Olbaltumvielu kvalitatīva un kvantitatīva noteikšana urīnā. Olbaltumvielu noteikšana urīnā ar Brandberga-Robertsa-Stoļņikova metodi

Ir viens no svarīgākajiem un pastāvīgas pazīmes nieru un urīnceļu slimības. Olbaltumvielu koncentrācijas noteikšana urīnā ir obligāta un svarīgs elements urīna testi. Proteīnūrijas identificēšana un kvantitatīvais novērtējums ir svarīgs ne tikai daudzu primāro un sekundāro nieru slimību diagnostikā, proteīnūrijas smaguma izmaiņu dinamikā novērtējums sniedz informāciju par norisi. patoloģisks process, par ārstēšanas efektivitāti. Olbaltumvielu noteikšanai urīnā, pat nelielos daudzumos, vajadzētu būt satraucošai saistībā ar iespējama saslimšana nierēm vai urīnceļiem, un nepieciešama atkārtota pārbaude. Īpaši jāatzīmē, ka nav jēgas pētīt urīnu un jo īpaši noteikt urīna proteīnu, neievērojot visus tā savākšanas noteikumus.

Visas metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā var iedalīt:

Augstas kvalitātes,
daļēji kvantitatīvs,
Kvantitatīvs.

Kvalitatīvās metodes

Viss augstas kvalitātes olbaltumvielu paraugi urīnā pamatojoties uz olbaltumvielu spēju denaturēties dažādu fizikālu un ķīmisku faktoru ietekmē. Ja testa urīna paraugā ir olbaltumvielas, parādās duļķainas vai flokulētas nogulsnes.

Nosacījumi olbaltumvielu noteikšanai urīnā, pamatojoties uz koagulācijas reakciju:

Urīnam jābūt skābam. Sārmainas reakcijas urīnu paskābina ar vairākiem (2-3) pilieniem etiķskābes (5-10%).
Urīnam jābūt dzidram. Dūmu noņem caur papīra filtru. Ja duļķainība nepazūd, pievienojiet talku vai sadedzinātu magnēziju (apmēram 1 tējkarote uz 100 ml urīna), sakratiet un filtrējiet.
Kvalitātes pārbaude jāveic divās mēģenēs, no kurām viena ir kontroles.
Migla jāmeklē uz melna fona caurlaidīgā gaismā.

Kvalitatīvas metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā ietver:

viršanas tests un citi.

Daudzi pētījumi ir parādījuši, ka neviena no daudzajām zināmajām metodēm olbaltumvielu kvalitatīvai noteikšanai urīnā nesniedz ticamus un reproducējamus rezultātus. Neskatoties uz to, vairumā CDL Krievijā šīs metodes tiek plaši izmantotas kā skrīnings - urīnā ar pozitīvu kvalitatīvu reakciju tās tiek veiktas tālāk. kvantitatīvā noteikšana vāvere. No kvalitatīvajām reakcijām biežāk tiek izmantots Gellera tests un sulfosicilskābes tests, tomēr sulfosicilskābes tests parasti tiek uzskatīts par vispiemērotāko patoloģiskas proteīnūrijas noteikšanai. Viršanas tests šobrīd praktiski netiek izmantots tā darbietilpības un ilguma dēļ.

Puskvantitatīvās metodes

UZ daļēji kvantitatīvās metodes attiecas:

olbaltumvielu noteikšana urīnā, izmantojot diagnostikas testa strēmeles.

Brandberga-Roberta-Stolņikova metodes pamatā ir Gellera gredzena tests, tāpēc ar šo metodi tiek novērotas tādas pašas kļūdas kā Gellera testā.

Mūsdienās proteīna noteikšanai urīnā arvien vairāk tiek izmantotas diagnostikas sloksnes. Lai daļēji kvantitatīvi noteiktu olbaltumvielu daudzumu urīnā uz sloksnes, kā indikatoru visbiežāk izmanto bromfenolzilo krāsvielu citrāta buferšķīdumā. Olbaltumvielu saturu urīnā nosaka pēc zilganzaļās krāsas intensitātes, kas veidojas pēc reakcijas zonas saskares ar urīnu. Rezultātu novērtē vizuāli vai izmantojot urīna analizatorus. Neskatoties uz sausās ķīmijas metožu lielo popularitāti un acīmredzamajām priekšrocībām (vienkāršība, analīzes ātrums), šīm urīna analīzes metodēm kopumā un jo īpaši olbaltumvielu noteikšanai nav bez nopietniem trūkumiem. Viens no tiem, kas izraisa diagnostikas informācijas izkropļojumus, ir bromfenolzilā indikatora lielāka jutība pret albumīnu salīdzinājumā ar citiem proteīniem. Šajā sakarā testa strēmeles galvenokārt ir pielāgotas selektīvās glomerulārās proteīnūrijas noteikšanai, kad gandrīz viss urīna proteīns ir albumīns. Progresējot izmaiņas un pārejot selektīvai glomerulārajai proteīnūrijai uz neselektīvu (globulīnu parādīšanās urīnā), olbaltumvielu noteikšanas rezultāti ir nepietiekami novērtēti salīdzinājumā ar patiesajām vērtībām. Šis fakts neļauj izmantot šo metodi olbaltumvielu noteikšanai urīnā, lai novērtētu nieru stāvokli (glomerulāro filtru) dinamikā. Tubulārās proteīnūrijas gadījumā arī proteīna noteikšanas rezultāti ir nepietiekami novērtēti. Olbaltumvielu noteikšana, izmantojot testa strēmeles, nav uzticams rādītājs zems līmenis proteīnūrija (lielākajai daļai pašlaik ražoto diagnostikas sloksņu nav iespējas uztvert olbaltumvielas urīnā koncentrācijā, kas mazāka par 0,15 g / l). Negatīvie rezultāti proteīna noteikšana uz sloksnēm neizslēdz globulīnu, hemoglobīna, uromukoīda, Bens-Jones proteīna un citu paraproteīnu klātbūtni urīnā.

Gļotu pārslas ar augstu glikoproteīnu saturu (piemēram, iekaisuma procesos urīnceļu, piūrija, bakteriūrija) var nosēsties uz sloksnes indikatora zonas un novest pie viltus pozitīviem rezultātiem. Viltus pozitīvus rezultātus var saistīt arī ar augstu urīnvielas koncentrāciju. Slikts apgaismojums un krāsu redzes problēmas var izraisīt neprecīzus rezultātus.

Šajā sakarā diagnostikas sloksņu izmantošana būtu jāierobežo ar skrīninga procedūrām, un ar to palīdzību iegūtie rezultāti jāuzskata tikai par indikatīviem.

Kvantitatīvās metodes

Pareizi olbaltumvielu daudzuma noteikšana urīnā dažos gadījumos izrādās biedējošs uzdevums... Grūtības tās risināšanā nosaka šādi faktori:

zems proteīna saturs veselīga cilvēka urīnā, kas bieži vien ir pie visvairāk zināmo metožu sliekšņa;
daudzu savienojumu klātbūtne urīnā, kas var traucēt ķīmisko reakciju gaitu;
būtiskas urīna olbaltumvielu satura un sastāva svārstības dažādu slimību gadījumos, kas apgrūtina atbilstoša kalibrēšanas materiāla izvēli.

Klīniskajās laboratorijās galvenokārt izmanto tā sauktās "rutīnas" metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā, taču tās ne vienmēr ļauj iegūt apmierinošus rezultātus.

No profesionāla laboratorijā strādājoša analītiķa viedokļa metodei, kas paredzēta olbaltumvielu daudzuma noteikšanai urīnā, jāatbilst šādām prasībām:

ir lineāra sakarība starp ķīmiskās reakcijas laikā izveidotā kompleksa uzsūkšanos un proteīna saturu paraugā plašā koncentrāciju diapazonā, kas ļaus izvairīties no papildu operācijām, sagatavojot paraugu pētniecībai;
jābūt vienkāršai, neprasa augstu izpildītāja kvalifikāciju, jāveic ar nelielu darbību skaitu;
ir augsta jutība, analītiskā uzticamība, izmantojot nelielus testa materiāla daudzumus;
jābūt izturīgam pret dažādiem faktoriem (izlases sastāva svārstībām, zāļu klātbūtnei utt.);
ir pieņemamas izmaksas;
jābūt viegli pielāgojamam autoanalizatoriem;
noteikšanas rezultāts nedrīkst būt atkarīgs no analizētā urīna parauga olbaltumvielu sastāva.

Neviena no pašlaik zināmajām metodēm proteīna kvantitatīvā noteikšanai urīnā nevar pilnībā pretendēt uz "zelta standarta" lomu.

Kvantitatīvās metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā var iedalīt turbidimetriskās un kolorimetriskās.

Turbidimetriskās metodes

Turbidimetriskās metodes ietver:

proteīna noteikšana ar sulfosalicilskābi (SSA),
olbaltumvielu noteikšana ar trihloretiķskābi (TCA),
proteīna noteikšana ar benzetonija hlorīdu.

Turbidimetrisko metožu pamatā ir urīna proteīnu šķīdības samazināšanās, ko izraisa suspendētu daļiņu suspensijas veidošanās izgulsnētāju ietekmē. Olbaltumvielu saturu testa paraugā nosaka vai nu pēc gaismas izkliedes intensitātes, ko nosaka pēc gaismu izkliedējošo daļiņu skaita (nefelometriskās analīzes metode), vai pēc gaismas plūsmas vājināšanās ar iegūto suspensiju (turbidimetriskās analīzes metode).

Gaismas izkliedes daudzums nogulsnēšanas metodēs olbaltumvielu noteikšanai urīnā ir atkarīgs no daudziem faktoriem: reaģentu sajaukšanas ātruma, reakcijas maisījuma temperatūras, barotnes pH, svešu savienojumu klātbūtnes un fotometrijas metodēm. Rūpīga reakcijas apstākļu ievērošana rada stabilu suspensiju ar nemainīgu daļiņu izmēru un salīdzinoši reproducējamus rezultātus.

Dažas medikamentiem var ietekmēt turbidimetrisko metožu rezultātus olbaltumvielu noteikšanai urīnā, izraisot tā sauktos "viltus pozitīvus" vai "viltus negatīvus" rezultātus. Tie ietver dažas antibiotikas (benzilpenicilīnu, kloksacilīnu utt.), Radiopagnētiskās jodu saturošas vielas, sulfa zāles.

Turbidimetriskās metodes ir grūti standartizēt, bieži noved pie iegūšanas kļūdaini rezultāti, taču, neskatoties uz to, pašlaik tos plaši izmanto laboratorijās zemo izmaksu un reaģentu pieejamības dēļ. Krievijā visplašāk izmantotā metode ir olbaltumvielu noteikšana ar sulfosalicilskābi.

Kolorimetriskās metodes

Visjutīgākās un precīzākās ir kolorimetriskās metodes kopējā urīna proteīna noteikšanai, pamatojoties uz specifiskām proteīnu krāsu reakcijām.

Tie ietver:

biureta reakcija,
Lourija metode,
metodes, kuru pamatā ir dažādu krāsvielu spēja veidot kompleksus ar olbaltumvielām:
- Ponceau S (Ponceau S),
- Coomassie Brilliant Blue
- Pirogalols sarkans.

No izpildītāja viedokļa laboratorijas ikdienas darbā ar lielu pētījumu plūsmu biureta metode ir neērta lielā operāciju skaita dēļ. Tajā pašā laikā metodei ir raksturīga augsta analītiskā ticamība, tā ļauj noteikt proteīnu plašā koncentrāciju diapazonā un noteikt albumīnu, globulīnus un paraproteīnus ar salīdzināmu jutību, kā rezultātā biureta metode tiek uzskatīta par standartmetodi. un ieteicams salīdzināt ar citām analītiskām metodēm olbaltumvielu noteikšanai urīnā. Biureta metodi proteīna noteikšanai urīnā vēlams veikt nefroloģiskos departamentus apkalpojošās laboratorijās un gadījumos, kad ar citām metodēm noteikšanas rezultāti ir apšaubāmi, kā arī diennakts proteīna zuduma daudzuma noteikšanai nefroloģiskiem pacientiem.

Lowry metode, kurai ir augstāka jutība salīdzinājumā ar biureta metodi, apvieno biureta reakciju un Folīna reakciju uz aminoskābēm tirozīnu un triptofānu proteīna molekulā. Neskatoties uz augsto jutību, šī metode ne vienmēr nodrošina ticamus rezultātus, nosakot olbaltumvielu saturu urīnā. Iemesls tam ir Folina reaģenta nespecifiskā mijiedarbība ar urīna neolbaltumvielām (visbiežāk aminoskābēm, urīnskābi, ogļhidrātiem). Šo un citu urīna komponentu atdalīšana ar dialīzi vai proteīnu izgulsnēšanu ļauj veiksmīgi izmantot šo metodi olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšanai urīnā. Dažas zāles - salicilāti, hlorpromazīns, tetraciklīni - var ietekmēt šo metodi un izkropļot pētījuma rezultātus.

Pietiekama jutība, laba reproducējamība un viegla proteīna noteikšana, piesaistot krāsvielas, padara šīs metodes daudzsološas, taču reaģentu augstās izmaksas neļauj tos plašāk izmantot laboratorijās. Pašlaik metode ar pirogalola sarkano krāsu Krievijā kļūst arvien izplatītāka.

Veicot proteīnūrijas līmeņa izpēti, jāpatur prātā, ka dažādām proteīnūrijas noteikšanas metodēm ir atšķirīga jutība un specifiskums pret daudziem urīna proteīniem.

proteīnūrija = 0,4799 B + 0,5230 L;
proteīnūrija = 1,5484 B - 0,4825 S;
proteīnūrija = 0,2167 S + 0,7579 L;
proteīnūrija = 1,0748 P - 0,0986 B;
proteīnūrija = 1,0104 P - 0,0289 S;
proteīnūrija = 0,8959 P + 0,0845 L;

kur:
B- mērījuma rezultāts ar Coomassie G-250;
L- mērījumu rezultāts ar Lourija reaģentu;
P- mērījumu rezultāts ar pirogalola molibdātu;
S- mērījumu rezultāts ar sulfosalicilskābi.

Ņemot vērā izteiktās proteīnūrijas līmeņa svārstības atšķirīgs laiks dienās, kā arī olbaltumvielu koncentrācijas urīnā atkarība no diurēzes, tā dažādais saturs atsevišķās urīna daļās, šobrīd ar nieru patoloģiju proteīnūrijas smagumu pieņemts novērtēt pēc ikdienas olbaltumvielu zuduma urīnā. urīnu, tas ir, lai noteiktu tā saukto ikdienas proteīnūriju. To izsaka g / dienā.

Ja nav iespējams savākt ikdienas urīnu, proteīna un kreatinīna koncentrāciju ieteicams noteikt vienā urīna porcijā. Tā kā kreatinīna izdalīšanās ātrums dienas laikā ir diezgan nemainīgs un nav atkarīgs no urinēšanas ātruma izmaiņām, olbaltumvielu koncentrācijas attiecība pret kreatinīna koncentrāciju ir nemainīga. Šī attiecība labi korelē ar ikdienas olbaltumvielu izdalīšanos, un tāpēc to var izmantot, lai novērtētu proteīnūrijas smagumu. Parasti olbaltumvielu/kreatinīna attiecībai jābūt mazākai par 0,2. Proteīnu un kreatinīnu mēra g/l. Svarīga metodes priekšrocība proteīnūrijas smaguma noteikšanai pēc olbaltumvielu un kreatinīna attiecības ir pilnīga kļūdu novēršana, kas saistītas ar neiespējamību vai nepilnīgu ikdienas urīna savākšanu.

Literatūra:

OV Novoselova, MB Pyatigorskaya, Yu. E. Mihailov, "Proteinūrijas noteikšanas un novērtēšanas klīniskie aspekti", CDL vadītāja rokasgrāmata, Nr. 1, 2007. gada janvāris
A. V. Kozlovs, "Proteīnūrija: tās noteikšanas metodes", lekcija, Sanktpēterburga, SPbMAPO, 2000.g.
V. L. Emanuels, " Laboratorijas diagnostika nieru slimība. Urīna sindroms ", - CDL vadītāja rokasgrāmata, Nr. 12, 2006. gada decembris.
UN. Pupkova, L.M. Prasolova - olbaltumvielu noteikšana urīnā un cerebrospinālajā šķidrumā. Kolcova, 2007
Klīniskā atsauce laboratorijas metodes pētījumiem. Ed. E. A. Kosts. Maskava, "Medicīna", 1975

Neliels daudzums olbaltumvielu ikdienas urīnā ir atrodams diezgan veseliem cilvēkiem tomēr ar pašreizējām metodēm tik zemas koncentrācijas netiek noteiktas atsevišķās porcijās. Apmēram 70% no olbaltumvielām veselīga cilvēka urīnā ir uromukoīds, olbaltumviela, kas ir nieru audu produkts; tādējādi glomerulārā proteīna īpatsvars urīnā veseliem cilvēkiem ir niecīgs, un proteīnūrija parasti ir 50–150 mg dienā, un lielākā daļa urīna proteīnu ir identiski seruma proteīniem.

Ir pieņemts atšķirt šādas veidlapas proteīnūrija atkarībā no izcelsmes vietas: prerenāla, saistīta ar pastiprinātu audu proteīna sadalīšanos, izteikta hemolīze; nieres, nieru slimības dēļ, ko var iedalīt glomerulāros un cauruļveida; postrenāls, kas saistīts ar urīnceļu patoloģiju un visbiežāk izraisa iekaisuma eksudācija.

Atkarībā no pastāvēšanas ilguma tiek izolēta pastāvīga proteīnūrija, kas pastāv daudzas nedēļas un pat gadus, un pārejoša, kas parādās periodiski, dažreiz pat tad, ja nav nieru patoloģijas, piemēram, ar drudzi un smagu intoksikāciju. Ieteicams atšķirt proteīnūrijas mainīgumu: ar ikdienas olbaltumvielu zudumu līdz 1 g - vidēji, no 1 līdz 3 g - vidēji un vairāk nekā 3 g - izteikti.

Olbaltumvielu ar relatīvi augstu molekulmasu noteikšana urīnā norāda uz nieru filtra selektivitātes trūkumu un tā izteiktiem bojājumiem. Šajos gadījumos viņi runā par zemu proteīnūrijas selektivitāti. Tāpēc šobrīd urīna olbaltumvielu frakciju noteikšana ir kļuvusi plaši izplatīta. Visprecīzākās elektroforēzes metodes cietē un poliakrilamīda gēlā.
Pēc ar šīm metodēm iegūtajiem rezultātiem var spriest par proteīnūrijas selektivitāti.

Lielākā daļa kvalitatīvo un kvantitatīvo metožu olbaltumvielu noteikšanai urīnā ir balstītas uz tā koagulāciju urīna tilpumā vai saskarsmē starp barotnēm (urīnu un skābi); ja ir veids, kā izmērīt koagulācijas intensitāti, tad paraugs kļūst kvantitatīvs.

Standartizēts paraugs ar sulfosicilskābi:

Nepieciešamais reaģents:

20% sulfosalicilskābes šķīdums.

Pētījuma progress:

3 ml filtrēta urīna ielej 2 mēģenēs. Pievienojiet mēģenē 6-8 pilienus reaģenta. Uz tumša fona salīdziniet kontroles mēģeni ar eksperimentālo. Duļķainība mēģenē norāda uz olbaltumvielu klātbūtni, paraugs tiek uzskatīts par pozitīvu.

Ja urīna reakcija ir sārmaina, tad pirms pārbaudes to paskābina ar 2-3 pilieniem 10% etiķskābes šķīduma.

Vienotā Brandberga-Roberta-Stoļņikova metode:

Metodes pamatā ir Gellera gredzena tests, kas sastāv no tā, ka slāpekļskābes un urīna saskarnē proteīna klātbūtnē notiek tā koagulācija un parādās balts gredzens.

Nepieciešamais reaģents:

30% slāpekļskābes šķīdums (relatīvais blīvums 1,2) vai Larionovas reaģents.
Larionovas reaģenta pagatavošana: 20-30 g nātrija hlorīda karsējot izšķīdina 100 ml destilēta ūdens, ļauj atdzist, filtrē. 99 ml filtrāta pievieno 1 ml koncentrētas slāpekļskābes.

Pētījuma progress:

Mēģenē ielej 1-2 ml slāpekļskābes (vai Larionovas reaģenta) un tikpat daudz filtrētā urīna rūpīgi noslāņo gar mēģenes sieniņu. Plāna balta gredzena parādīšanās uz divu šķidrumu robežas 2–3 minūšu laikā norāda uz proteīna klātbūtni aptuveni 0,033 g / l koncentrācijā. Ja gredzens parādās agrāk nekā 2 minūtes pēc laminēšanas, urīns ir jāatšķaida ar ūdeni un jāveic jau atšķaidītā urīna pārslāņošana. Urīna atšķaidīšanas pakāpi izvēlas atkarībā no gredzena veida, t.i. tā platums, kompaktums un parādīšanās laiks. Ar pavedienu gredzenu, kas parādījās agrāk 2 minūtes, urīns tiek atšķaidīts 2 reizes, ar platu - 4 reizes, ar kompaktu - 8 reizes utt. Šajā gadījumā olbaltumvielu koncentrāciju aprēķina, reizinot 0,033 ar atšķaidījuma pakāpi, un izsaka gramos uz litru (g / l).

Dažreiz balts gredzens tiek iegūts, kad ir lielos daudzumos urats. Atšķirībā no proteīna gredzena, urāts parādās nedaudz virs saskarnes starp diviem šķidrumiem un izšķīst, viegli karsējot.

Olbaltumvielu daudzuma noteikšana urīnā pēc duļķainības, kas rodas, pievienojot sulfosalicilskābi:

Metodes princips:

Duļķainības intensitāte olbaltumvielu koagulācijas laikā ar sulfosacilskābi ir proporcionāla tās koncentrācijai.

Nepieciešamie reaģenti:

1,3% sulfosalicilskābes šķīdums.

2. 0,9% nātrija hlorīda šķīdums.

3. Standarta albumīna šķīdums - 1% šķīdums (1 ml šķīduma, kas satur 10 mg albumīna): 1 g liofilizēta albumīna (no cilvēka vai liellopa seruma) izšķīdina nelielā daudzumā 0,9% nātrija hlorīda šķīduma kolbā ar ietilpība 100 ml, un pēc tam uzpildīt līdz atzīmei ar to pašu šķīdumu. Reaģentu stabilizē, pievienojot 1 ml 5% nātrija azīda (NaN3) šķīduma. Ja uzglabā ledusskapī, reaģents ir izmantojams 2 mēnešu laikā.

Speciālais aprīkojums - fotoelektriskais kolorimetrs.

Pētījuma progress:

Mēģenē pievieno 1,25 ml filtrēta urīna, pievieno 5 ml ar 3% sulfosalicilskābes šķīdumu, samaisa. Pēc 5 minūtēm to mēra ar fotoelektrisko kolorimetru pie viļņa garuma 590–650 nm (oranžs vai sarkans filtrs) pret kontroli kivetē ar optiskā ceļa garumu 5 mm. Par kontroli kalpo mēģene, kurā 0,9% nātrija hlorīda šķīdums tika pievienots 1,25 ml filtrēta urīna līdz 5 ml. Aprēķins tiek veikts saskaņā ar kalibrēšanas grafiku, kura uzbūvei no standartšķīduma sagatavo atšķaidījumus, kā norādīts tabulā.

No katra iegūtā šķīduma ņem 1,25 ml un apstrādā kā eksperimentālos paraugus.

Taisnās attiecības, veidojot kalibrēšanas grafiku, tiek saglabātas līdz 1 g / L. Pie lielākām koncentrācijām paraugs ir jāatšķaida un aprēķinos jāņem vērā atšķaidījums.

Ja urīnā ir organisko jodu saturošas kontrastvielas, var iegūt viltus pozitīvus rezultātus. Tāpēc testu nevar izmantot personām, kuras lieto joda preparātus; viltus pozitīvs tas var būt saistīts arī ar sulfa zāļu uzņemšanu, lielām penicilīna devām un augstu urīnskābes koncentrāciju urīnā.

Biureta metode:

Metodes princips:

Olbaltumvielu peptīdu saites ar vara sāļiem sārmainā c veido kompleksu violets... Olbaltumvielas ir iepriekš izgulsnētas ar trihloretiķskābi.

Nepieciešamie reaģenti:

1. 10% trihloretiķskābes šķīdums.
2,20% vara šķīdums (CuSO4 ∙ 5H2O).
3,3% NaOH šķīdums.

Pētījuma progress:

5 ml urīna, kas ņemts no dienas daudzuma, pievieno 3 ml trihloretiķskābes šķīduma, centrifugē līdz nemainīgam nogulšņu tilpumam. Supernatanta šķidrumu atsūc ar pipeti, pēc tam nogulsnes izšķīdina 5 ml NaOH šķīduma. Šķīdumam pievieno 0,25 ml CuSO4, maisījumu maisa un centrifugē. Supernatanta šķidrums ir fotometrisks pie viļņa garuma 540 nm kivetē ar optiskā ceļa garumu 10 mm pret destilētu ūdeni. Olbaltumvielu koncentrāciju aprēķina, izmantojot kalibrēšanas līkni, kad proteīna koncentrāciju (g/l) zīmē uz ordinātām un absorbciju ekstinkcijas vienībās uz abscisas. Iegūto koncentrāciju izmanto, lai aprēķinātu ikdienas olbaltumvielu zudumu urīnā.

Indikatora papīra (sloksnes) izmantošana:

Olbaltumvielu var noteikt, izmantojot indikatorpapīru (sloksnes), ko ražo Albuphan, Ames (Anglija), Albustix, Boehringer (Vācija), Comburtest u.c.

Princips ir balstīts uz dažu skābju-bāzes indikatoru tā saukto proteīna kļūdu fenomenu. Papīra indikatora daļa ir piesūcināta ar tetrabromfenolzilo un citrāta buferšķīdumu. Kad papīrs ir samitrināts, buferšķīdums izšķīst un nodrošina atbilstošu pH indikatora reakcijai.

Pie 3,0-3,5 proteīnu aminogrupas reaģē ar indikatoru un sākotnēji to maina dzeltens krāsojums līdz zaļgani zilai, pēc tam, salīdzinot ar krāsu skalu, var aptuveni novērtēt proteīna koncentrāciju izmeklējamā urīnā. Teststrēmeles pareizas darbības pamatnosacījums ir uzturēt pH 3,0-3,5 diapazonā, lai reakcija noritētu.

Ja papīrs saskaras ar pētāmo urīnu ilgāk par instrukcijā norādīto ekspozīciju, tad tajā izšķīst citrāta buferšķīdums, un tad indikators reaģē uz patieso urīna pH, t.i. sniedz viltus pozitīvu reakciju. Tā kā bufera kapacitāte ir ierobežota, pat ja tiek ievēroti metodiskie norādījumi, kļūdaini pozitīvi rezultāti tiek iegūti pārāk sārmaina urīna paraugos (pH> 6,5), kā arī pārāk skāba urīna paraugos (pH).
Reaģējošo aminogrupu skaits atsevišķu proteīnu sastāvā ir atšķirīgs, tāpēc albumīni reaģē 2 reizes intensīvāk nekā tāds pats daudzums γ-globulīnu (Bens-Jones proteīns, paraproteīni) un daudz intensīvāk nekā glikoproteīni. Tomēr, ja ir liels gļotu daudzums ar augstu glikoproteīnu saturu (ar urīnceļu iekaisumu), gļotu pārslas, kas nogulsnētas uz testa strēmeles, var sniegt kļūdaini pozitīvus rezultātus.

Indikatora papīra atsevišķu ražošanas partiju, kā arī viena uzņēmuma ražoto atsevišķu papīra veidu jutīgums var būt atšķirīgs, tāpēc proteīna kvantitatīvā novērtēšana, izmantojot šo metodi, ir jāizturas piesardzīgi. Dienas olbaltumvielu zudumu urīnā noteikt, izmantojot indikatorpapīru, nav iespējams. Tādējādi indikatorpapīrs ir zemāks par ķīmiskajiem paraugiem, galvenokārt paraugam ar sulfosacilskābi, lai gan tas ļauj ātri izpētīt virkni paraugu.

Bens-Jones proteīna noteikšana urīnā:

Bens-Jones proteīns var izdalīties ar urīnu ar multiplo mielomu, Valdenstrema makroglobulinēmiju.

Pētījumu ieteicams veikt tikai ar pozitīvu sulfosacilskābes testu. Bens-Jones proteīna testa papīrs nav piemērots.

Princips:

Pamatojoties uz termoprecipitācijas reakciju. Metodes, ar kurām tiek aprēķināta Bens-Jones proteīna izšķīdināšana 100 ° C temperatūrā vai atkārtota nogulsnēšanās ar sekojošu dzesēšanu, nav uzticamas, jo ne visiem Bens-Jones proteīna ķermeņiem ir atbilstošās īpašības. Visticamākā šī paraproteīna identifikācija ir tā nokrišņi 40-60 ° C temperatūrā, taču pat šādos apstākļos nokrišņi var nenotikt pārāk skābā (pH 6,5) urīnā, pie zema relatīvā urīna blīvuma un zema. Bens-Jones proteīna koncentrācija.

Nepieciešamie reaģenti:

2 M acetāta buferšķīdums pH 4,9.

Pētījuma progress:

Filtrētu urīnu 4 ml apjomā sajauc ar 1 ml buferšķīduma un 15 minūtes karsē ūdens vannā 56 ° C temperatūrā. Bens-Jones proteīnu klātbūtnē 2 minūšu laikā parādās izteiktas nogulsnes; ja Bensa-Džonsa proteīna koncentrācija ir mazāka par 3 g / l, paraugs var izrādīties negatīvs. Praksē tas notiek ārkārtīgi reti, jo lielākoties Bence-Jones proteīna koncentrācija urīnā ir ievērojama.

Ar pilnīgu ticamību Bens-Jones proteīnu var noteikt ar imūnelektroforētisku pētījumu, izmantojot specifiskus serumus pret smagajām un vieglajām imūnglobulīnu ķēdēm.

Albumozes (proteozes) definīcija:

Albumozes ir olbaltumvielu sadalīšanās produkti, kuru noteikšanas princips ir balstīts uz to, ka vārīšanās laikā tie nesalocās, bet dod pozitīvu biureta reakciju un tiek izsālīti ar dažiem sāļiem, īpaši ar amonija sulfātu un cinka acetātu skābā vidē.

Normāls urīns nesatur albumozi. Var būt pēdas normāls urīns spermas piejaukuma gadījumā. Patoloģijas gadījumā albumoze var rasties urīnā drudža apstākļos, asins un plazmas pārliešanas, eksudātu un transudātu rezorbcijas un audzēja sabrukšanas laikā.

Nepieciešamie reaģenti:

1. Piesātināts nātrija hlorīda šķīdums.
2. Koncentrēts nātrija hidroksīda šķīdums.
3. Vājš vara sulfāta šķīdums (gandrīz bezkrāsains).

Pētījuma progress:

Ar etiķskābi paskābinātam urīnam pievieno piesātinātu nātrija hlorīda šķīdumu (1/3 tilpuma), uzvāra un karsto šķidrumu filtrē. Albumozes nonāk filtrātā, kurā to klātbūtni nosaka biureta reakcija. Filtrātam pievieno 1/2 tilpuma koncentrēta nātrija hidroksīda šķīduma un dažus pilienus vāja vara sulfāta šķīduma. Ja paraugs ir pozitīvs, iegūst sarkani violetu krāsu.

Ja tests ir pozitīvs ar sulfosalicilskābi, urīns tiek uzkarsēts. Ja duļķainība pazūd un atkal parādās pēc atdzesēšanas, tas nozīmē, ka urīnā ir albumīns vai Bens-Jones proteīna ķermenis.

Neliels olbaltumvielu daudzums ir atrodams ikdienas urīnā veseliem cilvēkiem. Tomēr šādas nelielas koncentrācijas nevar noteikt, izmantojot parastās pētniecības metodes. Lielāka daudzuma olbaltumvielu izdalīšanos, kurā normāls kvalitatīvs olbaltumvielu tests urīnā kļūst pozitīvs, sauc par proteīnūriju. Atšķiriet nieru (patieso) un ārpusnieru (viltus) proteīnūriju. Nieru proteīnūrijas gadījumā proteīns iekļūst urīnā tieši no asinīm, jo palielinās nieru glomerulu filtrācija vai samazinās tubulārā reabsorbcija.

Nieru (īstā) proteīnūrija

Nieru (īstā) proteīnūrija ir funkcionāla un organiska. Starp funkcionālo nieru proteīnūriju visbiežāk tiek novēroti šādi veidi:

Jaundzimušo fizioloģiskā proteīnūrija, kas izzūd 4-10 dienā pēc dzimšanas, un priekšlaicīgi dzimušiem zīdaiņiem nedaudz vēlāk;
- ortostatiskā albumīnūrija, kas raksturīga bērniem vecumā no 7 līdz 18 gadiem un parādās tikai vertikālā ķermeņa stāvoklī;
- pārejoša (insults) albuminūrija, ko var izraisīt dažādas gremošanas sistēmas slimības, smaga anēmija, apdegumi, traumas vai fizioloģiski faktori: liela fiziska slodze, hipotermija, spēcīgas emocijas, bagātīga, olbaltumvielām bagāta pārtika utt.

Organisko (nieru) proteīnūriju novēro olbaltumvielu izvadīšanas rezultātā no asinīm caur bojātām nieru glomerulu endotēlija zonām nieru slimību (glomerulonefrīts, nefroze, nefroskleroze, amiloidoze, grūtnieču nefropātija), nieru hemodinamikas traucējumi. (nieru vēnu hipertensija, hipoksija) (trofiskais un toksiskais zāļu skaits) ietekmē glomerulu kapilāru sieniņas.

Ārpusnieru (viltus) proteīnūrija

Ekstrarenāla (viltus) proteīnūrija, kurā olbaltumvielu avots urīnā ir leikocītu, eritrocītu, baktēriju, urotēlija šūnu maisījums. novērota uroloģisko slimību gadījumā (urolitiāze, nieru tuberkuloze, nieru un urīnceļu audzēji utt.).

Olbaltumvielu noteikšana urīnā

Lielākā daļa kvalitatīvo un kvantitatīvo metožu olbaltumvielu noteikšanai urīnā ir balstītas uz tā koagulāciju urīna tilpumā vai saskarnē starp barotnēm (urīnu un skābi).

Starp kvalitatīvajām metodēm slikta urīna noteikšanai urīnā visizplatītākās ir vienotais tests ar sulfosicilskābi un Gellera gredzena tests.

Standartizēto testu ar sulfasalicilskābi veic šādi. 3 ml filtrēta urīna ielej 2 mēģenēs. Vienā no tiem pievieno 6-8 pilienus 20% sulfasalicilskābes šķīduma. Salīdziniet abas caurules uz tumša fona. Duļķains urīns sulfasalicilskābes mēģenē norāda uz olbaltumvielu klātbūtni. Pirms pētījuma ir jānosaka urīna reakcija, un, ja tas ir sārmains, tad paskābina ar 2-3 pilieniem 10% etiķskābes šķīduma.

Gellera tests ir balstīts uz faktu, ka proteīna klātbūtnē urīnā slāpekļskābes un urīna saskarnes vietā tas koagulējas un parādās balts gredzens. Mēģenē ielej 1-2 ml 30% slāpekļskābes šķīduma un tikpat daudz filtrēta urīna rūpīgi uzklāj uz mēģenes sieniņas. Balta gredzena parādīšanās pie abu šķidrumu robežas norāda uz olbaltumvielu klātbūtni urīnā. Jāatceras, ka dažreiz balts gredzens veidojas, kad ir liels skaits urāti, bet atšķirībā no proteīna gredzena, tas parādās nedaudz virs robežas starp diviem šķidrumiem un karsējot izšķīst [Pletneva NG, 1987].

No kvantitatīvajām metodēm visbiežāk tiek izmantotas:

1) vienotā Brandberga-Roberta-Stoļņikova metode, kuras pamatā ir Gellera gredzena tests;
2) fotoelektriskā kolorimetriskā metode olbaltumvielu kvantitatīvai noteikšanai urīnā pēc duļķainības, kas veidojas, pievienojot sulfasalicilskābi;
3) biureta metode.

Vienkāršota urīna proteīna noteikšana ātrais ceļš veikta ar kolorimetrisko metodi, izmantojot indikatorpapīru, ko ražo firmas "Lachema" (Slovākija), "Albuphan", "Ames" (Anglija), "Albustix", "Boehringer" (Vācija), "Comburtest" u.c. Metode sastāv no tetrabromfenolzilā un citrāta buferšķīdumā samērcētas īpašas papīra sloksnes iegremdēšanas urīnā, kas maina savu krāsu no dzeltenas uz zilu atkarībā no olbaltumvielu satura urīnā. Aptuveni olbaltumvielu koncentrāciju pētāmajā urīnā nosaka, izmantojot standarta skalu. Lai iegūtu pareizus rezultātus, ir jāievēro šādi nosacījumi. urīna pH jābūt diapazonā no 3,0 līdz 3,5; pārāk sārmains urīns (pH 6,5) radīs kļūdaini pozitīvu rezultātu, kā arī skābs urīns(pH 3,0) - viltus negatīvs.

Papīram jābūt saskarē ar testa urīnu ne ilgāk, kā norādīts instrukcijās citādi tests sniegs kļūdaini pozitīvu reakciju. Pēdējais tiek novērots arī tad, ja urīnā ir liels daudzums gļotu. Jutīgums dažādi veidi un papīra partijas var atšķirties, tāpēc olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana urīnā, izmantojot šo metodi, ir jāizturas piesardzīgi. Tā daudzumu ikdienas urīnā noteikt ar indikatorpapīru nav iespējams [Pletneva NG, 1987]

Dienas proteīnūrijas noteikšana

Ir vairāki veidi, kā noteikt olbaltumvielu daudzumu, kas izdalās ar urīnu dienā. Vienkāršākā ir Brandberga-Roberta-Stolņikova metode.

Metodoloģija. Mēģenē ielej 5-10 ml rūpīgi sajaukta dienas urīna un gar tās sieniņām uzmanīgi pievieno 30% slāpekļskābes šķīdumu. Ja urīnā ir 0,033% olbaltumvielu (t.i., 33 mg uz 1 litru urīna), pēc 2-3 minūtēm parādās plāns, bet skaidri redzams balts gredzens. Pie zemākas koncentrācijas paraugs ir negatīvs. Ja urīnā ir lielāks olbaltumvielu saturs, tā daudzumu nosaka, atkārtoti atšķaidot urīnu ar destilētu ūdeni, līdz gredzens pārtrauc veidoties. Pēdējā mēģenē, kurā gredzens joprojām ir redzams, olbaltumvielu koncentrācija būs 0,033%. Reizinot ar 0,033 ar urīna atšķaidīšanas ātrumu, nosaka proteīna saturu 1 litrā neatšķaidīta urīna gramos. Pēc tam olbaltumvielu saturu ikdienas urīnā aprēķina, izmantojot formulu:

K = (x V) / 1000

kur K ir olbaltumvielu daudzums ikdienas urīnā (g); x ir olbaltumvielu daudzums 1 litrā urīna (g); V ir dienā izdalītā urīna daudzums (ml).

Parasti dienas laikā ar urīnu izdalās no 27 līdz 150 mg (vidēji 40-80 mg) olbaltumvielu.

Šis tests ļauj urīnā noteikt tikai smalkās olbaltumvielas (albumīnu). Precīzākas kvantitatīvās metodes (Kjeldāla kolorimetriskā metode u.c.) ir diezgan sarežģītas un prasa īpašu aprīkojumu.

Nieru proteīnūrijas gadījumā ar urīnu izdalās ne tikai albumīns, bet arī citi proteīnu veidi. Normālai proteinogrammai (saskaņā ar Seitz et al., 1953) ir šāds procentuālais daudzums: albumīns - 20%, α 1 -globulīni - 12%, α 2 -globulīni - 17%, γ-globulīni - 43% un β-globulīni - 8%... Dažādu nieru slimību gadījumā mainās albumīnu un globulīnu attiecība, t.i. tiek traucēta kvantitatīvā attiecība starp olbaltumvielu frakcijām.

Visizplatītākās uroproteīnu frakcionēšanas metodes ir šādas: izsālīšana ar neitrāliem sāļiem, elektroforētiskā frakcionēšana, imunoloģiskās metodes (radiālā imūndifūzija pēc Mančīni, imūnelektroforētiskā analīze, izgulsnēšanās imūnelektroforēze), hromatogrāfija, gēla filtrēšana un ultracentrifugēšana.

Saistībā ar uroproteīnu frakcionēšanas metožu ieviešanu, pamatojoties uz elektroforētiskās mobilitātes, molekulmasas mainīguma, uroproteīna molekulu lieluma un formas izpēti, radās iespēja izdalīt konkrētai slimībai raksturīgus proteīnūrijas veidus, izpētīt uroproteīnu klīrensu. atsevišķi plazmas proteīni. Līdz šim urīnā ir identificēti vairāk nekā 40 plazmas proteīni, tostarp 31 plazmas proteīns normālā urīnā.

Selektīva proteīnūrija

Pēdējos gados ir parādījies proteīnūrijas selektivitātes jēdziens. 1955. gadā Hārdviks un Skvairs formulēja "selektīvas" un "neselektīvas" proteīnūrijas jēdzienu, nosakot, ka plazmas proteīnu filtrēšana urīnā atbilst noteiktam modelim: jo lielāka ir ar urīnu izdalītā proteīna molekulmasa, jo mazāka. tā klīrenss un jo zemāka tā koncentrācija urīnā.galīgais urīns. Šim modelim atbilstošā proteīnūrija ir selektīva, atšķirībā no neselektīvas, ko raksturo atvasinātā modeļa perversija.

Olbaltumvielu ar relatīvi augstu molekulmasu noteikšana urīnā norāda uz nieru filtra selektivitātes trūkumu un tā izteiktiem bojājumiem. Šajos gadījumos viņi runā par zemu proteīnūrijas selektivitāti. Tāpēc šobrīd plaši izplatīta ir urīna proteīnu frakciju noteikšana, izmantojot elektroforēzes metodes cietē un poliakrilamīda gēlā. Pēc šo pētījumu metožu rezultātiem var spriest par proteīnūrijas selektivitāti.

Saskaņā ar V. S. Makhlina (1975), vispamatotākā ir proteīnūrijas selektivitātes noteikšana, salīdzinot 6-7 atsevišķu asins plazmas olbaltumvielu (albumīna, tranferīna, α 2 - makroglobulīna, IgA, IgG, IgM) klīrensu, izmantojot precīzu un specifisku. radiālās imūndifūzijas reakcijas kvantitatīvās imunoloģiskās metodes pēc Mančīni, imūnelektroforētiskā analīze un nokrišņu imūnelektroforēze. Proteīnūrijas selektivitātes pakāpi nosaka selektivitātes indekss, kas ir salīdzināmo un atsauces proteīnu (albumīna) attiecība.

Atsevišķu plazmas proteīnu klīrensa izpēte ļauj iegūt ticamu informāciju par nieru glomerulu filtrācijas bazālo membrānu stāvokli. Saikne starp ar urīnu izvadīto olbaltumvielu dabu un glomerulu bazālo membrānu izmaiņām ir tik izteikta un nemainīga, ka pēc uroproteinogrammas var netieši spriest par patofizioloģiskām izmaiņām nieru glomerulos. Parasti glomerulārās bazālās membrānas vidējais poru izmērs ir 2,9-4 A ° NM, kas var izvadīt olbaltumvielas ar molekulmasu līdz 10 4 (mioglobulīns, skābais α 1 - glikoproteīns, imūnglobulīna vieglās ķēdes, Fc un Fab - IgG fragmenti, albumīns un transferīns).

Ar glomerulonefrītu, nefrotisko sindromu palielinās poru izmēri glomerulu bazālās membrānās, un tāpēc bazālā membrāna kļūst caurlaidīga olbaltumvielu molekulām. liels izmērs un masas (ceruloplazmīns, haptoglobīns, IgG, IgA utt.). Ar ārkārtēju nieru glomerulu bojājumu pakāpi urīnā parādās milzīgas asins plazmas olbaltumvielu molekulas (α 2 -makroglobulīns, IgM un β 2 -lipoproteīns).

Nosakot urīna olbaltumvielu spektru, var izdarīt secinājumu par dominējošo bojājumu dažās nefrona zonās. Glomerulonefrītu ar dominējošu glomerulāro bazālo membrānu bojājumu raksturo lielas un vidējas molekulmasas olbaltumvielu klātbūtne urīnā. Pielonefrītu ar dominējošu kanāliņu bazālo membrānu bojājumu raksturo lielmolekulāru proteīnu trūkums un palielināts vidējas un zemas molekulmasas olbaltumvielu daudzums.

β2 -mikroglobulīns

Papildus labi zināmiem proteīniem, piemēram, albumīnam, imūnglobulīniem, lipoproteīniem. fibrinogēns, transferīns, urīns satur plazmas mikroproteīnus, starp kuriem klīniski nozīmīgs ir β 2 -mikroglobulīns, ko 1968. gadā atklāja Berggards un Bērns. Tām ir zema molekulmasa (relatīvā molekulmasa 1800), tas brīvi iziet cauri nieru glomeruliem un gandrīz pilnībā reabsorbēts proksimālajās kanāliņos. Tas ļauj kvantitatīvi noteikt β 2 -mikroglobulīnu asinīs un urīnā, lai noteiktu glomerulāro filtrāciju un nieru spēju resorbēt proteīnus proksimālajās kanāliņos.

Šī proteīna koncentrāciju asins plazmā un urīnā nosaka ar radioimūno testu, izmantojot standarta komplektu "Phade-bas β 2 -mikroiest" (Pharmasia, Zviedrija). Veselu cilvēku asins serums satur vidēji 1,7 mg / l (svārstības no 0,6 līdz 3 mg / l), urīnā - vidēji 81 μg / l (maksimums 250 μg / l) β 2 -mikroglobulīnu. Tā pārpalikums urīnā virs 1000 mcg/l ir patoloģiska parādība. β 2 -mikroglobulīna saturs asinīs palielinās slimību gadījumā, ko pavada glomerulārās filtrācijas traucējumi, īpaši akūtu un hronisku glomerulonefrītu, policistisku nieru slimību, nefrosklerozi, diabētisko nefropātiju, akūtu nieru mazspēju.

β 2 -mikroglobulīna koncentrācija urīnā palielinās slimību gadījumā, ko pavada kanāliņu reabsorbcijas funkcijas pārkāpums, kas izraisa tā izdalīšanos urīnā 10-50 reizes, īpaši ar pielonefrītu, hronisku nieru slimību. neveiksme, strutojoša intoksikācija utt. Raksturīgi, ka ar cistītu pie Atšķirībā no pielonefrīta urīnā nepalielinās β 2 -mikroglobulīna koncentrācija, ko var izmantot šo slimību diferenciāldiagnozei. Tomēr, interpretējot pētījuma rezultātus, jāpatur prātā, ka jebkura temperatūras paaugstināšanās vienmēr ir saistīta ar palielinātu β 2 -mikroglobulīna izdalīšanos urīnā.

Vidējas asins un urīna molekulas

Vidējās molekulas (SM), ko citādi sauc par olbaltumvielu toksīniem, ir vielas, kuru molekulmasa ir 500-5000 daltonu. To fiziskā struktūra nav zināma. CM sastāvs ietver vismaz 30 peptīdus: oksitocīnu, vazopresīnu, angiotenzīnu, glikagonu, adrenokortikotropo hormonu (AKTH) utt. Pārmērīga CM uzkrāšanās tiek novērota ar nieru darbības samazināšanos un liela skaita deformētu saturu asinīs. olbaltumvielas un to metabolīti. Tiem piemīt dažāda bioloģiska iedarbība un tie ir neirotoksiski, izraisa sekundāru imūnsupresiju, sekundāru anēmiju, kavē proteīnu biosintēzi un eritropoēzi, kavē daudzu enzīmu darbību un izjauc iekaisuma procesa fāzes.

CM līmeni asinīs un urīnā nosaka ar skrīninga testu, kā arī ar spektrofotometriju ultravioletajā zonā pie viļņu garumiem 254 un 280 mm uz DI-8B spektrofotometra, kā arī dinamisko spektrofotometriju ar datoru apstrādi viļņu garuma diapazonā. 220-335 nm uz tā paša Bekmena spektrometra ... Norma tiek ņemta par CM saturu asinīs, kas vienāda ar 0,24 ± 0,02 srvc. vienību, un urīnā - 0,312 ± 0,09 konv. vienības
Tā kā tie ir normāli ķermeņa atkritumi, tie parasti tiek izvadīti no tā naktī ar glomerulārās filtrācijas palīdzību par 0,5%; 5% no tiem tiek iznīcināti citā veidā. Visas CM frakcijas tiek pakļautas cauruļveida reabsorbcijai.

Neplazmas (audu) uroproteīni

Papildus asins plazmas olbaltumvielām urīns var saturēt neplazmas (audu) proteīnus. Saskaņā ar Buxbaum un Franklin (1970) neplazmas olbaltumvielas veido aptuveni 2/3 no visiem urīna biokoloīdiem un ievērojamu daļu uroproteīnu patoloģiskas proteīnūrijas gadījumā. Audu proteīni nokļūst urīnā tieši no nierēm vai orgāniem, kas anatomiski saistīti ar urīnceļu, vai arī nonāk asinīs no citiem orgāniem un audiem un no tā caur nieru glomerulu bazālo membrānu urīnā. Pēdējā gadījumā audu proteīnu izdalīšanās urīnā ir līdzīga dažādu molekulmasu plazmas olbaltumvielu izdalīšanai. Neplazmas uroproteīnu sastāvs ir ārkārtīgi daudzveidīgs. Starp tiem ir glikoproteīni, hormoni, antigēni, fermenti (fermenti).

Audu proteīnus urīnā nosaka, izmantojot tradicionālās proteīnu ķīmijas metodes (ultracentrifugēšana, gēla hromatogrāfija, dažādas iespējas elektroforēze), specifiskas reakcijas uz fermentiem un hormoniem un imunoloģiskās metodes. Pēdējie arī ļauj noteikt neplazmas uroproteīna koncentrāciju urīnā un dažos gadījumos noteikt audu struktūras, kas kļuva par tā parādīšanās avotu. Galvenā metode neplazmas proteīna noteikšanai urīnā ir imūndifūzijas analīze ar antiserumu, ko iegūst, imunizējot eksperimentālos dzīvniekus ar cilvēka urīnu un pēc tam noārda (adsorbē) ar asins plazmas olbaltumvielām.

Fermentu izpēte asinīs un urīnā

Patoloģiskajā procesā tiek novēroti dziļi šūnu dzīvībai svarīgās aktivitātes traucējumi, ko papildina intracelulāro enzīmu izdalīšanās ķermeņa šķidrumos. Enzimodiagnostika balstās uz vairāku enzīmu noteikšanu, kas izdalās no skarto orgānu šūnām un nav raksturīgi asins serumam.
Cilvēku un dzīvnieku nefrona pētījumi ir parādījuši, ka tā atsevišķās daļās ir augsta fermentatīvā diferenciācija, kas ir cieši saistīta ar funkcijām, kuras veic katrs departaments. Nieru glomerulos satur relatīvi neliels daudzums dažādi fermenti.

Nieru kanāliņu šūnas, īpaši proksimālās, satur maksimālo fermentu daudzumu. To augstā aktivitāte tiek novērota Henles cilpā, taisnās kanāliņos un savākšanas kanālos. Atsevišķu enzīmu aktivitātes izmaiņas dažādu nieru slimību gadījumā ir atkarīgas no procesa rakstura, smaguma pakāpes un lokalizācijas. Tie tiek novēroti pirms morfoloģisko izmaiņu parādīšanās nierēs. Tā kā dažādu enzīmu saturs ir skaidri lokalizēts nefronā, viena vai otra enzīma noteikšana urīnā var veicināt nieru patoloģiskā procesa (glomerulos, kanāliņos, kortikālajā vai medulārajā slānī) lokālu diagnostiku, diferenciāldiagnozi. nieru slimību un procesa dinamikas (novājināšanās un saasināšanās) noteikšana nieru parenhīmā.

Uroģenitālās sistēmas slimību diferenciāldiagnozei izmanto šādu enzīmu aktivitātes noteikšanu asinīs un urīnā: laktāta dehidrogenāze (LDH), leicīna aminopeptidāze (LAP), skābā fosfatāze (AP), sārmainās fosfatāzes (ALP). ), β-glikuronidāze, glutamino-oksaloetiķskābes hidrohlorīda transamināze , aldolāze, transamidināze u.c. Fermentu aktivitāti asins serumā un urīnā nosaka, izmantojot bioķīmisko, spektrofotometrisko, hromatogrāfisko, fluorimetrisko un hemiluminiscences metodes.

Enzimūrija nieru slimībā ir izteiktāka un dabiskāka nekā enzīms. Tas ir īpaši izteikts slimības akūtā stadijā (akūts pielonefrīts, trauma, audzēja sabrukšana, nieru infarkts utt.). Šajās slimībās tiek konstatēta augsta transamidināzes, LDH, ALP un CF, hialuronidāzes, LAP, kā arī tādu nespecifisku enzīmu kā HHT, katalāzes aktivitāte [Polyantseva LR, 1972].

Selektīva enzīmu lokalizācija nefronā, kad urīnā tiek konstatēts LAP un ALP, ļauj ar pārliecību runāt par akūtām un hroniskām nieru slimībām (akūtu nieru mazspēju, nieru kanāliņu nekrozi, hronisku glomerulonefrītu) [Shemetov VD, 1968]. Saskaņā ar A. A. Karelin un L. R. Polyantseva (1965) teikto, transamidināzi satur tikai divi orgāni - nieres un aizkuņģa dziedzeris. Tas ir mitohondriju enzīms nierēs, un tā parasti nav asinīs un urīnā. Ar dažādām nieru slimībām transamidināze parādās asinīs un urīnā, bet ar aizkuņģa dziedzera bojājumiem - tikai asinīs.

Krotkiewski (1963) uzskata, ka sārmainās fosfatāzes aktivitāte urīnā ir diferenciālais tests glomerulonefrīta un pielonefrīta diagnostikā, kuras palielināšanās ir vairāk raksturīga pielonefrītam un diabētiskajai glomerulosklerozei nekā akūtam un hroniskam nefrītam. Pieaugošā amilāzēmijas dinamika ar vienlaicīgu amilazūrijas samazināšanos var liecināt par nefrosklerozi un nieru grumbu veidošanos, LAP ir vislielākā nozīme patoloģiskām izmaiņām nieru glomerulos un vītņotajos kanāliņos, jo tā saturs šajās nefrona daļās ir lielāks. Šepotinovskis VP et al., 1980]. Lupus nefrīta diagnosticēšanai ieteicams noteikt β-glikuronidāzi un CF [Privalenko M.N. et al., 1974].

Novērtējot enzīmurijas lomu nieru slimību diagnostikā, jāņem vērā šādi punkti. Fermenti, kas dabā ir olbaltumvielas, ar mazu molekulmasu var iziet cauri neskartiem glomeruliem, nosakot tā saukto fizioloģisko enzīmuriju. Starp šiem fermentiem urīnā pastāvīgi tiek konstatēta α-amilāze (relatīvā molekulmasa 45 000) un uropepsīns (relatīvais molekulmasa 38 000).

Līdzās zemas molekulmasas enzīmiem veselu indivīdu urīnā nelielā koncentrācijā var atrast arī citus enzīmus: LDH, aspartāta un alanīna aminotransferāzes, sārmainās fosfatāzes un CP, maltāzi, aldolāzi, lipāzi, dažādas proteāzes un peptidāzes, sulfatāzi, katalāzi, ribonukleāze, peroksidāze.

Augstas molekulmasas enzīmi, kuru relatīvā molekulmasa ir lielāka par 70 000-100 000, saskaņā ar Rihteriha (1958) un Hesa (1962) datiem, var iekļūt urīnā tikai tad, ja ir traucēta glomerulārā filtra caurlaidība. Normāls enzīmu saturs urīnā neļauj izslēgt patoloģisko procesu nierēs ar urīnvada oklūziju. Ar episimūriju enzīmi var izdalīties ne tikai no pašām nierēm, bet arī no citiem parenhīmas orgāniem, urīnceļu gļotādu šūnām, prostatas dziedzeriem, kā arī urīna asinsķermenīšiem ar hematūriju vai leikocitūriju.

Lielākā daļa enzīmu ir nespecifiski attiecībā uz nierēm, tāpēc ir grūti noteikt, no kurienes nāk veselu un slimu cilvēku urīnā atrodamie fermenti. Tomēr enzīmurijas pakāpe pat nespecifiskiem enzīmiem nieru bojājumu gadījumā ir augstāka par normālu vai citu orgānu slimību gadījumā. Vairāk vērtīgu informāciju var sniegt visaptverošu pētījumu par vairāku enzīmu dinamiku, īpaši orgāniem raksturīgu, piemēram, transamināžu.

Izlemjot jautājumu par enzīma nieru izcelsmi urīnā, palīdz izoenzīmu izpēte, nosakot pētāmajam orgānam raksturīgās frakcijas. Izoenzīmi ir fermenti, kas savā darbībā ir izogēni (katalizē vienu un to pašu reakciju), bet pēc ķīmiskās struktūras un citām īpašībām ir neviendabīgi. Katram audam ir raksturīgs izoenzīmu spektrs. Vērtīgas metodes izoenzīmu atdalīšanai ir elektroforēze cietes un poliakrilamīda gēlā, kā arī jonu apmaiņas hromatogrāfija.

Bens Jones proteīns

Ar multiplo mielomu un Valdenstrema makroglobulinēmiju urīnā tiek konstatēts Bens-Jones proteīns. Metode nosauktā proteīna noteikšanai urīnā ir balstīta uz termoprecipitācijas reakciju. Iepriekšējās metodes, kas novērtē šī proteīna izšķīšanu 100 ° C temperatūrā un atkārtotu izgulsnēšanos ar sekojošu dzesēšanu, nav uzticamas, jo ne visiem Bens-Jones proteīna ķermeņiem ir atbilstošās īpašības.

Šo paraproteīnu ir ticamāk identificēt, izgulsnējot to 40–60 ° C temperatūrā. Tomēr pat šādos apstākļos nokrišņi var nenotikt pārāk skābā (pH< 3,0—3,5) или слишком щелочной (рН >6.5) urīns ar zemu OPM un zemu Bens-Jones proteīna koncentrāciju. Vislabvēlīgākos apstākļus tā nogulsnēšanai nodrošina Patnem piedāvātā metode: 4 ml filtrēta urīna sajauc ar 1 ml 2 M acetāta buferšķīduma pH 4,9 un 15 minūtes silda ūdens vannā 56 ° C temperatūrā. Bens-Jones proteīna klātbūtnē pirmajās 2 minūtēs parādās izteiktas nogulsnes.

Ja Bens-Jones proteīna koncentrācija ir mazāka par 3 g / l, paraugs var būt negatīvs, taču praksē tas notiek ārkārtīgi reti, jo tā koncentrācija urīnā parasti ir nozīmīgāka. Uz verdošiem paraugiem nevar paļauties. Ar pilnīgu pārliecību to var noteikt urīnā ar imūnelektroforēzes metodi, izmantojot specifiskus serumus pret smagajām un vieglajām imūnglobulīnu ķēdēm.

Olbaltumvielas urīnā: noteikšanas metodes

Patoloģiska proteīnūrija ir viena no svarīgākajām un pastāvīgākajām nieru un urīnceļu slimības pazīmēm. Olbaltumvielu koncentrācijas noteikšana urīnā ir obligāts un svarīgs urīna analīzes elements. Proteīnūrijas identificēšana un kvantitatīvā novērtēšana ir svarīga ne tikai daudzu primāro un sekundāro nieru slimību diagnostikā, proteīnūrijas smaguma izmaiņu dinamikā novērtējums nes informāciju par patoloģiskā procesa gaitu, par ārstēšanas efektivitāti. Olbaltumvielu noteikšanai urīnā, pat nelielos daudzumos, vajadzētu būt satraucošai attiecībā uz iespējamu nieru vai urīnceļu slimību, un tā ir jāpārbauda atkārtoti. Īpaši jāatzīmē, ka nav jēgas pētīt urīnu un jo īpaši noteikt urīna proteīnu, neievērojot visus tās savākšanas noteikumi.

Visas metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā var iedalīt:

Augstas kvalitātes,

daļēji kvantitatīvs,

Kvantitatīvs.

Kvalitatīvās metodes

Nosacījumi olbaltumvielu noteikšanai urīnā, pamatojoties uz koagulācijas reakciju:

Urīnam jābūt skābam. Sārmainas reakcijas urīnu paskābina ar vairākiem (2-3) pilieniem etiķskābes (5-10%).

Urīnam jābūt dzidram. Dūmu noņem caur papīra filtru. Ja duļķainība nepazūd, pievienojiet talku vai sadedzinātu magnēziju (apmēram 1 tējkarote uz 100 ml urīna), sakratiet un filtrējiet.

Kvalitātes pārbaude jāveic divās mēģenēs, no kurām viena ir kontroles.

Migla jāmeklē uz melna fona caurlaidīgā gaismā.

Kvalitatīvas metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā ietver:

Gellera gredzena tests,

tests ar 15 - 20% sulfosalicilskābi,

viršanas tests un citi.

Daudzi pētījumi ir parādījuši, ka neviena no daudzajām zināmajām metodēm olbaltumvielu kvalitatīvai noteikšanai urīnā nesniedz ticamus un reproducējamus rezultātus. Neskatoties uz to, vairumā CDL Krievijā šīs metodes tiek plaši izmantotas kā skrīnings - urīnā ar pozitīvu kvalitatīvu reakciju tiek veikta turpmāka proteīna kvantitatīvā noteikšana. No kvalitatīvajām reakcijām biežāk tiek izmantots Gellera tests un sulfosicilskābes tests, tomēr sulfosicilskābes tests parasti tiek uzskatīts par vispiemērotāko patoloģiskas proteīnūrijas noteikšanai. Viršanas tests šobrīd praktiski netiek izmantots tā darbietilpības un ilguma dēļ.

Puskvantitatīvās metodes

UZ daļēji kvantitatīvās metodes attiecas:

Brandberga-Roberta-Stoļņikova metode,

olbaltumvielu noteikšana urīnā, izmantojot diagnostikas testa strēmeles.

Brandberga-Roberta-Stolņikova metodes pamatā ir Gellera gredzena tests, tāpēc ar šo metodi tiek novērotas tādas pašas kļūdas kā Gellera testā.

Mūsdienās proteīna noteikšanai urīnā arvien vairāk tiek izmantotas diagnostikas sloksnes. Lai daļēji kvantitatīvi noteiktu olbaltumvielu daudzumu urīnā uz sloksnes, kā indikatoru visbiežāk izmanto bromfenolzilo krāsvielu citrāta buferšķīdumā. Olbaltumvielu saturu urīnā nosaka pēc zilganzaļās krāsas intensitātes, kas veidojas pēc reakcijas zonas saskares ar urīnu. Rezultātu novērtē vizuāli vai izmantojot urīna analizatorus. Neskatoties uz sausās ķīmijas metožu lielo popularitāti un acīmredzamajām priekšrocībām (vienkāršība, analīzes ātrums), šīm urīna analīzes metodēm kopumā un jo īpaši olbaltumvielu noteikšanai nav bez nopietniem trūkumiem. Viens no tiem, kas izraisa diagnostikas informācijas izkropļojumus, ir bromfenolzilā indikatora lielāka jutība pret albumīnu salīdzinājumā ar citiem proteīniem. Šajā sakarā testa strēmeles galvenokārt ir pielāgotas selektīvās glomerulārās proteīnūrijas noteikšanai, kad gandrīz viss urīna proteīns ir albumīns. Progresējot izmaiņas un pārejot selektīvai glomerulārajai proteīnūrijai uz neselektīvu (globulīnu parādīšanās urīnā), olbaltumvielu noteikšanas rezultāti ir nepietiekami novērtēti salīdzinājumā ar patiesajām vērtībām. Šis fakts neļauj izmantot šo metodi olbaltumvielu noteikšanai urīnā, lai novērtētu nieru stāvokli (glomerulāro filtru) dinamikā. Tubulārās proteīnūrijas gadījumā arī proteīna noteikšanas rezultāti ir nepietiekami novērtēti. Olbaltumvielu noteikšana ar testa strēmelēm nav uzticams zema proteīnūrijas līmeņa rādītājs (lielākajai daļai pašlaik ražoto testa strēmeļu nav iespējams uztvert olbaltumvielas urīnā koncentrācijās, kas zemākas par 0,15 g / l). Negatīvie proteīna noteikšanas rezultāti uz sloksnēm neizslēdz globulīnu, hemoglobīna, uromukoīda, Bens-Jones proteīna un citu paraproteīnu klātbūtni urīnā.

Gļotu pārslas ar augstu glikoproteīnu saturu (piemēram, urīnceļu iekaisuma procesos, piūrija, bakteriūrija) var nosēsties uz sloksnes indikatora zonas un novest pie viltus pozitīviem rezultātiem. Viltus pozitīvus rezultātus var saistīt arī ar augstu koncentrāciju urīnviela... Slikts apgaismojums un krāsu redzes problēmas var izraisīt neprecīzus rezultātus.

Šajā sakarā diagnostikas sloksņu izmantošana būtu jāierobežo ar skrīninga procedūrām, un ar to palīdzību iegūtie rezultāti jāuzskata tikai par indikatīviem.

Kvantitatīvās metodes

Pareizi olbaltumvielu daudzuma noteikšana urīnā dažos gadījumos tas izrādās biedējošs uzdevums. Grūtības tās risināšanā nosaka šādi faktori:

daudzu savienojumu klātbūtne urīnā, kas var traucēt ķīmisko reakciju gaitu;

būtiskas urīna olbaltumvielu satura un sastāva svārstības dažādu slimību gadījumos, kas apgrūtina atbilstoša kalibrēšanas materiāla izvēli.

Klīniskajās laboratorijās galvenokārt izmanto tā sauktās "rutīnas" metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā, taču tās ne vienmēr ļauj iegūt apmierinošus rezultātus.

No profesionāla laboratorijā strādājoša analītiķa viedokļa metodei, kas paredzēta olbaltumvielu daudzuma noteikšanai urīnā, jāatbilst šādām prasībām:

ir lineāra sakarība starp ķīmiskās reakcijas laikā izveidotā kompleksa uzsūkšanos un proteīna saturu paraugā plašā koncentrāciju diapazonā, kas ļaus izvairīties no papildu operācijām, sagatavojot paraugu pētniecībai;

jābūt vienkāršai, neprasa augstu izpildītāja kvalifikāciju, jāveic ar nelielu darbību skaitu;

ir augsta jutība, analītiskā uzticamība, izmantojot nelielus testa materiāla daudzumus;

jābūt izturīgam pret dažādiem faktoriem (izlases sastāva svārstībām, zāļu klātbūtnei utt.);

ir pieņemamas izmaksas;

jābūt viegli pielāgojamam autoanalizatoriem;

noteikšanas rezultāts nedrīkst būt atkarīgs no analizētā urīna parauga olbaltumvielu sastāva.

Neviena no pašlaik zināmajām metodēm proteīna kvantitatīvā noteikšanai urīnā nevar pilnībā pretendēt uz "zelta standarta" lomu.

Kvantitatīvās metodes olbaltumvielu noteikšanai urīnā var iedalīt turbidimetriskās un kolorimetriskās.

Turbidimetriskās metodes

Turbidimetriskās metodes ietver:

proteīna noteikšana ar sulfosalicilskābi (SSA),

olbaltumvielu noteikšana ar trihloretiķskābi (TCA),

proteīna noteikšana ar benzetonija hlorīdu.

Dažas zāles ietekmē duļķainības metožu rezultātus olbaltumvielu noteikšanai urīnā, izraisot tā sauktos "viltus pozitīvus" vai "viltus negatīvus" rezultātus. Tie ietver dažas antibiotikas (benzilpenicilīnu, kloksacilīnu utt.), Radiopagnētiskās jodu saturošas vielas, sulfa zāles.

Turbidimetriskās metodes ir grūti standartizēt, bieži vien rada kļūdainus rezultātus, taču, neskatoties uz to, tās tagad plaši izmanto laboratorijās zemo izmaksu un reaģentu pieejamības dēļ. Krievijā visplašāk izmantotā metode ir olbaltumvielu noteikšana ar sulfosalicilskābi.

Kolorimetriskās metodes

Visjutīgākās un precīzākās ir kolorimetriskās metodes kopējā urīna proteīna noteikšanai, pamatojoties uz specifiskām proteīnu krāsu reakcijām.

Tie ietver:

biureta reakcija,

Lourija metode,

metodes, kuru pamatā ir dažādu krāsvielu spēja veidot kompleksus ar olbaltumvielām:

Ponceau S (Ponceau S),

Coomassie Brilliant Blue

Pirogalols sarkans.

Veicot proteīnūrijas līmeņa izpēti, jāpatur prātā, ka dažādām proteīnūrijas noteikšanas metodēm ir atšķirīga jutība un specifiskums pret daudziem urīna proteīniem.

Pamatojoties uz empīriskiem datiem, proteīnu ieteicams noteikt ar divām dažādām metodēm un aprēķināt patieso vērtību, izmantojot vienu no šādām formulām: proteīnūrija = 0,4799 B + 0,5230 L; proteīnūrija = 1,5484 B - 0,4825 S; proteīnūrija = 0,2167 S + 0,7579 L; proteīnūrija = 1,0748 P - 0,0986 B; proteīnūrija = 1,0104 P - 0,0289 S; proteīnūrija = 0,8959 P + 0,0845 L; kur B ir mērījuma rezultāts ar Coomassie G-250; L - mērījuma rezultāts ar Lourija reaģentu; P ir mērījumu rezultāts ar pirogalola molibdātu; S - mērījumu rezultāts ar sulfosalicilskābi.

Ņemot vērā izteiktās proteīnūrijas līmeņa svārstības dažādos diennakts laikos, kā arī olbaltumvielu koncentrācijas urīnā atkarību no diurēzes, tā atšķirīgo saturu atsevišķās urīna daļās, šobrīd ar nieru patoloģiju ir ierasts novērtēt proteīnūrijas smagumu pēc ikdienas olbaltumvielu zuduma urīnā, tas ir, noteikt tā saukto ikdienas proteīnūriju. To izsaka g / dienā.

Literatūra:

OV Novoselova, MB Pyatigorskaya, Yu. E. Mihailov, "Proteinūrijas noteikšanas un novērtēšanas klīniskie aspekti", CDL vadītāja rokasgrāmata, Nr. 1, 2007. gada janvāris

A. V. Kozlovs, "Proteīnūrija: tās noteikšanas metodes", lekcija, Sanktpēterburga, SPbMAPO, 2000.g.

V. L. Emanuels, “Nieru slimību laboratoriskā diagnostika. Urīna sindroms ", - CDL vadītāja rokasgrāmata, Nr. 12, 2006. gada decembris.

UN. Pupkova, L.M. Prasolova - metodes proteīna noteikšanai urīnā (literatūras datu apskats)

Klīniskās laboratorijas pētījumu metožu rokasgrāmata. Ed. E. A. Kosts. Maskava, "Medicīna", 197

Proteīnūrija (proteīnūrija) - olbaltumvielu parādīšanās urīnā koncentrācijās, kas ļauj to identificēt ar kvalitatīvām metodēm.

Atšķirt

Nieru proteīnūrija un
Ekstrarenālā (postrenālā) proteīnūrija

Nieru proteīnūrija

Nieru proteīnūriju izraisa glomerulārā filtra bojājums vai izliektā cauruļveida epitēlija disfunkcija.

Izdalīt selektīvo un neselektīvo proteīnūriju atkarībā no noteiktu plazmas un urīna olbaltumvielu attiecības, to molekulmasas un lādiņa.

Selektīva proteīnūrija

Selektīva proteīnūrija rodas ar minimālu (bieži vien atgriezenisku) glomerulārā filtra pārkāpumu, ko raksturo zemas molekulmasas olbaltumvielas (molekulārais svars nepārsniedz 68 000) - albumīns, ceruloplazmīns, transferīns.

Neselektīva proteīnūrija

Neselektīva proteīnūrija ir biežāk sastopama, ja filtrs ir smagāk bojāts, kad sāk zaudēt lielas molekulmasas olbaltumvielas. Proteīnūrijas selektivitāte ir svarīga diagnostikas un prognostiska iezīme.

Nieru proteīnūrija var būt:

organiskās un
funkcionāls (fizioloģisks).

Organiskā nieru proteīnūrija

Organiskā nieru proteīnūrija rodas ar nefrona organiskiem bojājumiem. Atkarībā no dominējošā rašanās mehānisma var izdalīt noteiktus organiskās proteīnūrijas veidus.

Glomerulārā proteīnūrija

Glomerulārā proteīnūrija - ko izraisa glomerulārā filtra bojājumi, rodas ar glomerulonefrītu un nefropātijām, kas saistītas ar vielmaiņas vai asinsvadu slimībām. (glomerulonefrīts, hipertensija, infekcijas un alerģisku faktoru darbība, sirdsdarbības dekompensācija)

Cauruļveida proteīnūrija

Cauruļveida proteīnūrija - saistīta ar kanāliņu nespēju reabsorbēt plazmas zemas molekulmasas olbaltumvielas, kas izgājušas caur nemainītu glomerulāro filtru. (amiloidoze, akūta tubulārā nekroze, intersticiāls nefrīts, Fankoni sindroms)

Prerenālā proteīnūrija

Prerenālā proteīnūrija (pārmērīga) - attīstās, ja plazmā ir neparasti augsta zemas molekulmasas proteīna koncentrācija, ko normāli glomerulos filtrē tādā daudzumā, kas pārsniedz kanāliņu fizioloģisko spēju reabsorbēties. (multiplā mieloma, muskuļu nekroze, eritrocītu hemolīze)

Funkcionālā nieru proteīnūrija

Funkcionālā nieru proteīnūrija nav saistīta ar nieru slimību, un tai nav nepieciešama ārstēšana.

Funkcionālā proteīnūrija ietver:

soļo,
emocionāls,
auksts,
apreibinošs,
ortostatisks (tikai bērniem un tikai stāvus).

Ekstrarenālā (postrenālā) proteīnūrija

Ar ekstrarenālu (postrenālu) proteīnūriju olbaltumvielas var iekļūt urīnā no urīnceļiem un dzimumorgāniem (ar kolpītu un vaginītu - ar nepareizu savāktais urīns). Šajā gadījumā tas ir nekas vairāk kā iekaisuma eksudāta piejaukums.

Ārpusnieru proteīnūrija, kā likums, nepārsniedz 1 g / dienā, bieži vien pārejoša.

Ekstrarenālās proteīnūrijas diagnostiku palīdz trīs stiklu tests un uroloģiskā izmeklēšana.

Postnieru proteīnūrija rodas ar cistītu, uretrītu.

Proteīna noteikšanas metodes urīnā

Proteīna pētījumu priekšnoteikums ir absolūta urīna skaidrība.

Kvalitatīvi paraugi

Sulfosalicilskābes tests

Divās mēģenēs ielej 3-4 ml filtrēta urīna. Mēģenē pievieno 6–8 pilienus 20% sulfosalicilskābes šķīduma. Otrā caurule ir kontrole. Uz tumša fona salīdziniet kontroles mēģeni ar eksperimentālo. Ja urīna paraugos ir olbaltumvielas, parādās opalescējoša migla.

Rezultāts tiek norādīts šādi:

reakcija ir vāji pozitīva (+),
pozitīvs (++),
izteikti pozitīvs (+++).

Paraugs ir ļoti jutīgs.

Var izmantot arī sausu paraugu, kad vairākiem mililitriem urīna pievieno vairākus sulfosicilskābes kristālus vai filtrpapīru, kas iepriekš samērcēts šīs skābes šķīdumā.

Viltus pozitīvi rezultāti var būt saistīts ar joda preparātu, sulfa preparātu, lielu penicilīna devu uzņemšanu un augstu urīnskābes koncentrāciju urīnā.

Slāpekļskābes tests (Gellera tests)

Mēģenē ielej 1-2 ml 50% slāpekļskābes šķīduma, pēc tam uz skābes uzklāj vienādu daudzumu urīna. Olbaltumvielu klātbūtnē uz divu šķidrumu robežas parādās balts gredzens. Dažreiz urātu klātbūtnes dēļ nedaudz virs robežas starp šķidrumiem veidojas sarkanīgi violetas krāsas gredzens. Urātu gredzens, atšķirībā no proteīna gredzena, izšķīst, viegli karsējot.

Spilgts tests

Spilgtas vārīšanās un proteīnūrijas skrīninga testiem (sausajiem kolorimetriskiem testiem) praktiski nav nepieciešami reaģenti.

Proteīnu saturošu urīnu vārot, tas denaturējas, veidojot duļķainas nogulsnes vai pārslas, kas atšķirībā no fosfātu sāļiem nešķīst 6% etiķskābē. Skrīninga testi balstās uz proteīna (albumīna) spēju mainīt ar indikatoru (parasti bromfenolzilo) un buferšķīdumu pārklāta papīra krāsu. Tiešā saistība starp indikatorpapīra krāsas intensitāti (Albufan, Albutest - Čehija; Labstix, Multistix - ASV; Comburtest - Vācija) un olbaltumvielu daudzumu ļauj aptuveni novērtēt proteīnūrijas daudzumu. Tomēr pašlaik izmantotajām skrīninga pārbaudēm nav nekādu trūkumu. Jo īpaši bromfenola zilais nenosaka Bens-Jones proteīnu.

Kvantitatīvās metodes

Brandberga - Roberta - Stolnikova metode

Metodes pamatā ir kvalitatīvs paraugs ar slāpekļskābi. Paraugs ir aprakstīts iepriekš. Rašanās plāns gredzens divu šķidrumu robežās no 2. līdz 3. minūtei pēc slāņošanās norāda uz 0,033 g / l olbaltumvielu klātbūtni urīnā (olbaltumvielu koncentrāciju urīnā parasti izsaka ppm, tas ir, gramos uz litru). Ja gredzens parādās agrāk nekā pēc 2 minūtēm, urīns jāatšķaida ar ūdeni. Urīna atšķaidījumu izvēlas tā, lai, uzklājot to uz slāpekļskābes, 2-3 minūtē parādītos gredzens. Atšķaidīšanas pakāpe ir atkarīga no gredzena platuma un kompaktuma un tā parādīšanās laika.

Olbaltumvielu koncentrāciju aprēķina, reizinot 0,033 g/l ar urīna atšķaidījumu (8. tabula).

Robertsa-Stolņikova atšķaidīšanas metodei ir vairāki trūkumi: tā ir subjektīva, darbietilpīga, olbaltumvielu koncentrācijas noteikšanas precizitāte samazinās, atšķaidot urīnu.

Ērtākās un precīzākās metodes ir nefelometriskās un biureta metodes.

Nefelometriskā metode

Tas ir balstīts uz proteīna īpašību radīt duļķainību ar sulfosalicilskābi, kuras intensitāte ir proporcionāla proteīna koncentrācijai. Graduētā mēģenē ielej 1,25 ml filtrēta urīna un pievieno 3% sulfosacilskābes šķīdumu līdz 5 ml tilpumam, rūpīgi samaisa. Pēc 5 minūtēm ekstinkcijas mēra ar FEK-M (vai jebkuru citu fotometru) pie viļņa garuma 590-650 nm (oranžs vai sarkans filtrs) pret kontroli kivetē ar slāņa biezumu 0,5 cm. Kontrolei izmantojiet 1,25 ml filtrēta urīna (tas pats), kam pievieno izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu līdz 5 ml tilpumam.

Ekstinkcijas vērtības atkarībai no proteīna koncentrācijas sākotnēji ir izveidota kalibrēšanas līkne. Standarta albumīna šķīdums (no cilvēka vai liellopa seruma) tiek izmantots dažādu olbaltumvielu koncentrāciju pagatavošanai. Aizpildiet darba lapu.

Biureta metode

Pamatojoties uz proteīna spēju dot violetu biureta kompleksu ar vara sulfātu un kodīgu sārmu, kura krāsas intensitāte ir tieši proporcionāla proteīna daudzumam. 2 ml urīna pievieno 2 ml trihloretiķskābes šķīduma, lai izgulsnētu proteīnu, un centrifugē. Supernatantu dekantē. Nogulsnēm (olbaltumvielām) pievieno 4 ml 3% NaOH šķīduma un 0,1 ml 20% vara sulfāta šķīduma, samaisa un centrifugē. Violetais supernatants ir fotometrisks pie viļņa garuma 540 nm (zaļais filtrs) pret destilētu ūdeni kivetē ar slāņa biezumu 1,0 cm Olbaltumvielu koncentrāciju nosaka saskaņā ar eksperimentāli iegūto tabulu (kalibrācijas līkne veidota tāpat kā iepriekšējā). metode).

Ortostatiskais tests

Tas ir indicēts, ja ir aizdomas par ortostatisku proteīnūriju un nefroptozi. Pēc pilnīgas iztukšošanas Urīnpūslis Pārbaudāmais notur horizontālu stāvokli 2 stundas, pēc tam, nepieceļoties, izdala vienu (kontroles) urīna porciju. Nākamo 2 stundu laikā subjekts nepārtraukti staigā, saglabājot maksimālo jostas lordozes stāvokli (turot nūju pie muguras lejasdaļas), pēc tam izdalot otro urīna porciju. Abās urīna daļās nosaka olbaltumvielu koncentrāciju un olbaltumvielu saturu gramos, bet ar nefroptozi - eritrocītu skaitu 1 ml. Ar ortostatisku proteīnūriju otrajā porcijā tiek konstatēta proteīnūrija vai sākotnējā olbaltumvielu satura palielināšanās gramos 2–3 reizes. Hematūrijas parādīšanās, bieži vien kombinācijā ar proteīnūriju otrajā daļā, ir raksturīga nefroptozei.

Bens-Jones uroproteīnu noteikšana

Bens-Jones proteīni ir termolabīli zemas molekulmasas paraproteīni (relatīvais molekulmass 20 000–45 000), kas galvenokārt atrodami multiplās mielomas un Valdenstrema makroglobulinēmijas gadījumā. Tās ir imūnglobulīna vieglās L-ķēdes. Sakarā ar to mazo molekulmasu, L-ķēdes viegli nonāk no asinīm caur neskartu nieru filtru urīnā, un tās var noteikt ar termiskās izgulsnēšanas reakciju. Pētījumu ieteicams veikt tikai ar pozitīvu sulfosacilskābes testu. Noteikšanu veic šādi. 10 ml urīna pievieno 3-4 pilienus 10% etiķskābes šķīduma un 2 ml piesātināta nātrija hlorīda šķīduma, viegli karsē ūdens vannā, pakāpeniski paaugstinot temperatūru. Ja urīnā ir Bens-Jones proteīni, tad 45-60 ° C temperatūrā parādās difūzs duļķainums vai veidojas blīvas baltas nogulsnes. Tālāk karsējot līdz vārīšanās temperatūrai, nogulsnes izšķīst, un pēc atdzesēšanas tās atkal parādās. Šis paraugs nav pietiekami jutīgs, un tas jāpārbauda ar elektroforēzes un imūnelektroforēzes metodēm.